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PCNA即增殖细胞核抗原，是一种分子量为36KD的核蛋白，它为细胞DNA多聚酶“δ”的辅助蛋白，是真核细胞DNA合成时所必需的一种酸性核蛋白。PCNA在细胞核内合成，并储存在核内，细胞处于静止状态时，其含量很低，当细胞进入增殖周期中，其表达明显增加，故PCNA是反映细胞增殖状态的良好指标。

• 对于贴壁细胞
  
  • 固定：将处理好的细胞爬片用4%多聚甲醛室温固定30～60分钟。
    
  • 洗涤：PBS洗2次，每次5分钟。
    
  • 通透：0.1%～0.5%的Triton X-100室温透膜10～15分钟。
    
  • 洗涤：PBST洗2次，每次5分钟。
    
  • 封闭：加适量Blocking Buffer (组分C)，湿盒中室温孵育30～60分钟。
    
  • 洗涤：PBS洗2次，每次5分钟。
    
  • 加一抗：按1:50用Blocking Buffer (组分C)稀释Anti-PCNA Rabbit antibody (组分A)；每个爬片中加入稀释好的Anti-PCNA Rabbit antibody (组分A)，4℃湿盒中孵育过夜。
    
  • 洗涤：PBS洗2次，每次5分钟。
    
  • 加酶标二抗：每个爬片加入适量HRP-标记驴抗兔IgG(组分B) (按1:50稀释)，室温，孵育60分钟。
    
  • 洗涤：PBS洗2次，每次5分钟。
    
  • DAB混合液的配制：DAB混合液的配制：将50μL DAB Substrate(20X)(组分E)以及50μL DAB Chromogen(20X)(组分F)稀释到900μL DAB Buffer(组分D)中，混匀。
    
  • 滴加50μL DAB混合液到每个爬片上，避光，室温孵育5～10分钟（视阳性组织显色情况判断）；
    
  • 终止显色：用蒸馏水终止显色反应。
    
  • 复染：每个组织滴加适量苏木素染液，染色1～5分钟。
    
    • 苏木素复染的时间依赖于所用的苏木素。
  • 洗涤：ddH2O洗2次，每次5分钟。
    
  • 75%乙醇中室温浸泡5分钟。
    
  • 85%乙醇中室温浸泡5分钟。
    
  • 95%乙醇中室温浸泡5分钟。
    
  • 二甲苯室温浸泡15分钟。
    
  • 中性树胶封片：加中性树胶盖玻片封片。
• 对于石蜡包埋的组织切片
  
  • 按照标准操作过程进行固定，脱蜡和水化；
    
  • 选择合适的抗原修复方法进行抗原修复；
    
  • 洗涤：洗涤：PBS洗2次，每次5分钟。
    
  • 灭活酶处理：3%H2O2-甲醇溶液，避光，室温处理15分钟。
    
    • 如果使用HRP偶联的抗体检测，这一步骤可以在这里也可以在加入一抗之后。
  • 洗涤：蒸馏水洗3次，每次2分钟。
    
  • 封闭：加适量Blocking Buffer (组分C)，湿盒中室温孵育30～60分钟。
    
  • 洗涤：PBS洗2次，每次5分钟。
    
  • 弃封闭液，弃封闭液，每个爬片中加入稀释好的Anti-PCNA Rabbit antibody（1:50） (组分A)，4℃湿盒中孵育过夜。
    
  • 洗涤：PBS洗3次，每次5分钟。
    
  • 加酶标二抗：每个爬片加入适量HRP-标记驴抗兔IgG (组分B)（1:250～1:500），室温，孵育60分钟。
    
  • 洗涤：PBS洗3次，每次5分钟。
    
  • DAB混合液的配制：将50μL DAB Substrate(20X) (组分E)以及50μL DAB Chromogen(20X) (组分F)稀释到900μL DAB Buffer (组分D)中，混匀。
    
  • 滴加50μL DAB混合液到每个爬片上，避光，室温孵育5～10分钟（视阳性组织显色情况判断）；
    
  • 终止显色：用蒸馏水终止显色反应。
    
  • 复染：每个组织滴加适量苏木素染液，染色1～5分钟。
    
    • 苏木素复染的时间依赖于所用的苏木素。
  • 洗涤：ddH2O洗3次，每次5分钟。
    
  • 75%乙醇中室温浸泡5分钟。
    
  • 85%乙醇中室温浸泡5分钟。
    
  • 95%乙醇中室温浸泡5分钟。
    
  • 二甲苯室温浸泡15分钟。
    
  • 中性树胶封片：加中性树胶盖玻片封片。